Análisis funcional de los dominios desmetilasa (AlkbB) conservados en la replicasa de dos vitivirus: efecto en la infección en Nicotiana sp.
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Título: Análisis funcional de los dominios desmetilasa (AlkbB) conservados en la replicasa de dos vitivirus: efecto en la infección en Nicotiana sp.
Autor: Contreras Lucas, Lorenzo
Resumen:
[ES] La metilación reversible del nitrógeno 6 (N6) de la adenosina (m6A) del RNA se realiza intrínsicamente por la acción concertada de algunas metiltransferasas y desmetilasas, y su efecto depende de otras proteínas que reconocen el RNA marcado. Esta modificación epigenética desempeña un papel fundamental en la regulación de diversas facetas del metabolismo del RNA en animales, plantas y levaduras, abarcando procesos como el plegamiento, la maduración, la exportación, la traducción y la degradación. Tanto en virus que afectan a mamíferos como a plantas, la modificación m6A del genoma viral también puede tener implicaciones para la virulencia, y el resultado específico (proviral o antiviral) depende de la naturaleza del virus. Un hallazgo reciente indica que la modificación m6A podría servir como un sistema de regulación antiviral en plantas. La acumulación de marcas m6A a lo largo del genoma del virus del mosaico de la alfalfa (AMV) conduce a una reducción de la acumulación viral y dificulta la invasión sistémica. No obstante, el virus ha desarrollado una estrategia para contrarrestar este efecto: la proteína de cubierta del AMV interacciona con una desmetilasa m6A citosólica, AtALKBH9B en Arabidopsis, probablemente reclutándola activamente al RNA viral. En este contexto, ALKBH9B regula la abundancia de m6A. En ausencia de ALKBH9B, los niveles elevados de m6A en el genoma viral provocan una disminución de la infección. En consecuencia, la modificación m6A mediada por el hospedador en el genoma de RNA de un virus invasor, desempeña un papel en un mecanismo de defensa antiviral, y la eliminación de esta marca distintiva asistida por el hospedador constituye una estrategia viral para contrarrestarlo. Las proteínas similares a la proteína de alquilación B (AlkB) de Escherichia coli que muestran actividad desmetilasa del RNA, pertenecen a la familia de las oxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato (2-OG) y Fe (II). Estas proteínas desempeñan un papel crucial en la protección del RNA y el DNA frente a los daños causados por los agentes metilantes. En concreto, reparan la 1-metiladenina y la 3-metilcitosina mediante la desmetilación oxidativa y la reversión directa de la base metilada a su forma no metilada. Los genes que codifican los homólogos de AlkB están ampliamente distribuidos en la naturaleza, y en los eucariotas a menudo constituyen familias génicas. Curiosamente, se han identificado dominios AlkB conservados, incluidos los motivos de unión a hierro (HXDXnH) y 2-OG (RXXXXXR), en las replicasas de ciertos virus de RNA monocatenario que pertenecen principalmente a las familias Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae y Closteroviridae, especialmente en aquellos que infectan leñosas. Aunque la función específica de estos dominios AlkB en el ciclo de infección de estos virus sigue siendo imprecisa, su conservación subraya su importancia potencial en el establecimiento de las relaciones virus-hospedador. Una caracterización funcional in vitro de los dominios AlkB de las replicasas del virus A de la vid (GVA), del virus de la quemadura del arándano (BlScV) y del virus Y de la zarzamora (BVY) proporcionó pruebas que apoyan la implicación de los dominios AlkB virales en la preservación de la integridad del RNA viral mediante la desmetilación oxidativa. Sin embargo, el papel específico y el impacto de estos dominios en el contexto de una infección siguen sin explorarse en detalle. En la actualidad la única prueba experimental sobre la funcionalidad de los dominios AlkB virales in vivo ha sido realizada en nuestro laboratorio. Estas investigaciones, centradas específicamente en el trichivirus de las manchas cloróticas del manzano (ACLSV), mostraron un impacto negativo durante la infección en Nicotiana occidentalis asociado con mutaciones dirigidas a los dominios AlkB de unión a hierro y/o 2-OG de la replicasa. En este trabajo fin de máster, nuestro objetivo final será explorar la funcionalidad de los dominios AlkB presentes en las replicasas d
[EN] Reversible methylation of adenosine nitrogen 6 (N6) (m6A) of RNA is carried out intrinsically by the concerted action of some methyltransferases and demethylases, and its effect depends on other proteins that recognise the tagged RNA. This epigenetic modification plays a key role in regulating various facets of RNA metabolism in animals, plants and yeast, including folding, maturation, export, translation and degradation. In both mammalian and plant viruses, m6A modification of the viral genome may also have implications for virulence, and the specific outcome (proviral or antiviral) depends on the nature of the virus. A recent finding indicates that m6A modification may serve as an antiviral regulatory system in plants. Accumulation of m6A marks along the alfalfa mosaic virus (AMV) genome leads to reduced viral accumulation and hinders systemic invasion. However, the virus has evolved a strategy to counteract this effect: the AMV coat protein interacts with a cytosolic m6A demethylase, AtALKBH9B in Arabidopsis, probably by actively recruiting it to the viral RNA. In this context, ALKBH9B regulates m6A abundance. In the absence of ALKBH9B, elevated levels of m6A in the viral genome lead to decreased infection. Consequently, host-mediated m6A modification in the RNA genome of an invading virus plays a role in an antiviral defence mechanism, and host-assisted deletion of this hallmark is a viral counter strategy. Escherichia coli alkylation protein B (AlkB)-like proteins that exhibit RNA demethylase activity belong to the family of 2-oxoglutarate (2-OG)- and Fe(II)-dependent oxygenases. These proteins play a crucial role in protecting RNA and DNA from damage caused by methylating agents. In particular, they repair 1-methyladenine and 3-methylcytosine by oxidative demethylation and direct reversion of the methylated base to its unmethylated form. Genes encoding AlkB homologues are widely distributed in nature, and in eukaryotes they often constitute gene families. Interestingly, conserved AlkB domains, including iron-binding (HXDXnH) and 2-OG (RXXXXXR) motifs, have been identified in the replicases of certain single-stranded RNA viruses belonging mainly to the families Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae and Closteroviridae, especially those infecting woody plants. However, the specific role and impact of these domains in the context of infection remains unexplored in detail. At present, the only experimental evidence for the functionality of viral AlkB domains in vivo has been performed in our laboratory. These investigations, specifically focused on the apple chlorotic spot trichivirus (ACLSV), showed a negative impact during infection in Nicotiana occidentalis associated with mutations targeting the iron-binding and/or 2-OG replicase AlkB domains. In this Master's thesis, our final objective is to explore the functionality of the AlkB domains present in the replicases of grapevine A and B viruses (GVA and GVB) during infection. Specifically, we will perform a mutational study of the AlkB domains in GVA and GVB using wild Nicotiana sp. plants. Furthermore, to analyse whether, as in the case of AMV, the endogenous AlkB activity of Nicotiana sp. could also participate in the demethylation of the viral genome, the effect of silencing of the two homologues of AtALKBH9B in Nicotiana sp., NbALKBH9B1 and NbALKBH9B2, on infection will be assessed. Therefore, our initial efforts will focus on obtaining an efficient system for silencing host demethylases using virus-induced silencing (VIGS). In addition, we will seek to obtain a battery of GVA and GVB mutants with altered AlkB domains. After infection in N. benthamiana, the viral titre of both viruses will be quantified by northern blot and qRT-PCR, as well as the silencing of the demethylases.
[ES] La metilación reversible del nitrógeno 6 (N6) de la adenosina (m6A) del RNA se realiza intrínsicamente por la acción concertada de algunas metiltransferasas y desmetilasas, y su efecto depende de otras proteínas que reconocen el RNA marcado. Esta modificación epigenética desempeña un papel fundamental en la regulación de diversas facetas del metabolismo del RNA en animales, plantas y levaduras, abarcando procesos como el plegamiento, la maduración, la exportación, la traducción y la degradación. Tanto en virus que afectan a mamíferos como a plantas, la modificación m6A del genoma viral también puede tener implicaciones para la virulencia, y el resultado específico (proviral o antiviral) depende de la naturaleza del virus. Un hallazgo reciente indica que la modificación m6A podría servir como un sistema de regulación antiviral en plantas. La acumulación de marcas m6A a lo largo del genoma del virus del mosaico de la alfalfa (AMV) conduce a una reducción de la acumulación viral y dificulta la invasión sistémica. No obstante, el virus ha desarrollado una estrategia para contrarrestar este efecto: la proteína de cubierta del AMV interacciona con una desmetilasa m6A citosólica, AtALKBH9B en Arabidopsis, probablemente reclutándola activamente al RNA viral. En este contexto, ALKBH9B regula la abundancia de m6A. En ausencia de ALKBH9B, los niveles elevados de m6A en el genoma viral provocan una disminución de la infección. En consecuencia, la modificación m6A mediada por el hospedador en el genoma de RNA de un virus invasor, desempeña un papel en un mecanismo de defensa antiviral, y la eliminación de esta marca distintiva asistida por el hospedador constituye una estrategia viral para contrarrestarlo. Las proteínas similares a la proteína de alquilación B (AlkB) de Escherichia coli que muestran actividad desmetilasa del RNA, pertenecen a la familia de las oxigenasas dependientes de 2-oxoglutarato (2-OG) y Fe (II). Estas proteínas desempeñan un papel crucial en la protección del RNA y el DNA frente a los daños causados por los agentes metilantes. En concreto, reparan la 1-metiladenina y la 3-metilcitosina mediante la desmetilación oxidativa y la reversión directa de la base metilada a su forma no metilada. Los genes que codifican los homólogos de AlkB están ampliamente distribuidos en la naturaleza, y en los eucariotas a menudo constituyen familias génicas. Curiosamente, se han identificado dominios AlkB conservados, incluidos los motivos de unión a hierro (HXDXnH) y 2-OG (RXXXXXR), en las replicasas de ciertos virus de RNA monocatenario que pertenecen principalmente a las familias Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae y Closteroviridae, especialmente en aquellos que infectan leñosas. Aunque la función específica de estos dominios AlkB en el ciclo de infección de estos virus sigue siendo imprecisa, su conservación subraya su importancia potencial en el establecimiento de las relaciones virus-hospedador. Una caracterización funcional in vitro de los dominios AlkB de las replicasas del virus A de la vid (GVA), del virus de la quemadura del arándano (BlScV) y del virus Y de la zarzamora (BVY) proporcionó pruebas que apoyan la implicación de los dominios AlkB virales en la preservación de la integridad del RNA viral mediante la desmetilación oxidativa. Sin embargo, el papel específico y el impacto de estos dominios en el contexto de una infección siguen sin explorarse en detalle. En la actualidad la única prueba experimental sobre la funcionalidad de los dominios AlkB virales in vivo ha sido realizada en nuestro laboratorio. Estas investigaciones, centradas específicamente en el trichivirus de las manchas cloróticas del manzano (ACLSV), mostraron un impacto negativo durante la infección en Nicotiana occidentalis asociado con mutaciones dirigidas a los dominios AlkB de unión a hierro y/o 2-OG de la replicasa. En este trabajo fin de máster, nuestro objetivo final será explorar la funcionalidad de los dominios AlkB presentes en las replicasas d
[EN] Reversible methylation of adenosine nitrogen 6 (N6) (m6A) of RNA is carried out intrinsically by the concerted action of some methyltransferases and demethylases, and its effect depends on other proteins that recognise the tagged RNA. This epigenetic modification plays a key role in regulating various facets of RNA metabolism in animals, plants and yeast, including folding, maturation, export, translation and degradation. In both mammalian and plant viruses, m6A modification of the viral genome may also have implications for virulence, and the specific outcome (proviral or antiviral) depends on the nature of the virus. A recent finding indicates that m6A modification may serve as an antiviral regulatory system in plants. Accumulation of m6A marks along the alfalfa mosaic virus (AMV) genome leads to reduced viral accumulation and hinders systemic invasion. However, the virus has evolved a strategy to counteract this effect: the AMV coat protein interacts with a cytosolic m6A demethylase, AtALKBH9B in Arabidopsis, probably by actively recruiting it to the viral RNA. In this context, ALKBH9B regulates m6A abundance. In the absence of ALKBH9B, elevated levels of m6A in the viral genome lead to decreased infection. Consequently, host-mediated m6A modification in the RNA genome of an invading virus plays a role in an antiviral defence mechanism, and host-assisted deletion of this hallmark is a viral counter strategy. Escherichia coli alkylation protein B (AlkB)-like proteins that exhibit RNA demethylase activity belong to the family of 2-oxoglutarate (2-OG)- and Fe(II)-dependent oxygenases. These proteins play a crucial role in protecting RNA and DNA from damage caused by methylating agents. In particular, they repair 1-methyladenine and 3-methylcytosine by oxidative demethylation and direct reversion of the methylated base to its unmethylated form. Genes encoding AlkB homologues are widely distributed in nature, and in eukaryotes they often constitute gene families. Interestingly, conserved AlkB domains, including iron-binding (HXDXnH) and 2-OG (RXXXXXR) motifs, have been identified in the replicases of certain single-stranded RNA viruses belonging mainly to the families Alphaflexiviridae, Betaflexiviridae and Closteroviridae, especially those infecting woody plants. However, the specific role and impact of these domains in the context of infection remains unexplored in detail. At present, the only experimental evidence for the functionality of viral AlkB domains in vivo has been performed in our laboratory. These investigations, specifically focused on the apple chlorotic spot trichivirus (ACLSV), showed a negative impact during infection in Nicotiana occidentalis associated with mutations targeting the iron-binding and/or 2-OG replicase AlkB domains. In this Master's thesis, our final objective is to explore the functionality of the AlkB domains present in the replicases of grapevine A and B viruses (GVA and GVB) during infection. Specifically, we will perform a mutational study of the AlkB domains in GVA and GVB using wild Nicotiana sp. plants. Furthermore, to analyse whether, as in the case of AMV, the endogenous AlkB activity of Nicotiana sp. could also participate in the demethylation of the viral genome, the effect of silencing of the two homologues of AtALKBH9B in Nicotiana sp., NbALKBH9B1 and NbALKBH9B2, on infection will be assessed. Therefore, our initial efforts will focus on obtaining an efficient system for silencing host demethylases using virus-induced silencing (VIGS). In addition, we will seek to obtain a battery of GVA and GVB mutants with altered AlkB domains. After infection in N. benthamiana, the viral titre of both viruses will be quantified by northern blot and qRT-PCR, as well as the silencing of the demethylases.
URI: http://hdl.handle.net/10251/214644
Fecha: 2025-02-20
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